一、實驗目的
了解倒置顯微鏡的構(gòu)造與使用，了解不同傳代細胞的形態(tài)及接毒后的病變特征，掌握細胞的傳代培養(yǎng)方法、病毒接種方法及收毒方法。
二、常用細胞的種類
BHK-21：倉鼠腎傳代細胞
PK-15：豬腎傳代細胞
IBRS-2：豬腎傳代細胞
Hela：人的子宮瘤細胞
Vero：非洲綠猴腎細胞
Marc-145：來源于Vero細胞
TK-143：人的胸苷激酶陰性細胞
Sf9：昆蟲細胞  
三、材料
1、100ml細胞瓶、吸管、吸球、96孔細胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭
2、BHK-21（baby hamster kidney）細胞
3、0.25%胰酶
4、生長液：含10%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM
  維持液：含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM
5、偽狂犬病病毒液（PRV）
四、傳代細胞培養(yǎng)的條件要求
1）細胞密度：2-3×10⁵個/ml
2）pH范圍   **適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培養(yǎng)溫度
   哺乳動物細胞一般為37℃
   昆蟲細胞28-30℃
五、常用細胞分散劑與作用原理
1、胰酶  使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導致細胞間質(zhì)水解而使細胞或組織塊消化為分散的單個細胞。
2、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）：與二價鈣、鎂離子結(jié)合，從而使細胞分散。
3、灰色鏈絲菌酶 ：由灰色鏈絲菌提取的一種酶制劑，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、營養(yǎng)液
1、人工綜合營養(yǎng)液
氨基酸、糖類、無機鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子。
2、血清
1）血清的種類
    胎牛血清、新生犢牛血清、成年牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犢牛血清使用**為廣泛。
2）血清的處理
無菌采集，過濾除菌。用前56℃滅活30min。
3）血清的作用
A、能提供細胞生存、生長和增生所必須的生長調(diào)節(jié)因子。
B、能補充基礎培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。
C、含有一些可供貼壁依賴型細胞在培養(yǎng)器皿表面貼附和鋪展的生長基質(zhì)成分。
D、有中和毒性物質(zhì)保護細胞不受傷害的作用。
E、給培養(yǎng)液提供良好的緩沖系統(tǒng)。
F、提供蛋白酶抑制劑，保護細胞免受細胞釋放的蛋白酶的損害。
4）應用血清存在的問題
A、血清中存在不少有害于細胞生長和繁殖的物質(zhì)：補體、免疫球蛋白、生長抑制因子。
B、血清的成分不明確，影響對結(jié)果的分析。
C、不同動物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。
七、傳代細胞系培養(yǎng)
1、優(yōu)點：1) 可以無限的傳代。
2) 不少細胞系對病毒很敏感。
3) 某些傳代細胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。
4) 生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。
缺點：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。
培養(yǎng)方法
1）取長滿單層的細胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培養(yǎng)箱放置幾分鐘，**細胞間出現(xiàn)空隙或細胞變圓后，倒去消化液。
3）加入生長液,反復吹打幾次，使細胞分散成單個細胞，然后分裝于3個小瓶中。再在每個小瓶中補充生長液**10ml，然后置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)1-2天即可長成單層。
八、病毒（PRV）在傳代細胞中的培養(yǎng)
1、選長滿單層的細胞，倒掉培養(yǎng)液。
2、加入適量的病毒懸液
3、置溫箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培養(yǎng)液，補足維持液，置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直**80%以上的細胞病變。
5、收毒：將病變的細胞置于-20℃冰箱中，凍結(jié)后取出自然解凍，在解凍過程中振搖幾次，以使細胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水瓶或其它容器中。低溫貯藏備用。
 
實驗四  病毒感染力的滴定（TCID₅₀的測定）
一、實驗目的
    了解病毒感染力測定的幾種常用方法，掌握半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量TCID₅₀的操作步驟、計算方法及含義。
二、測定病毒感染力的方法
半數(shù)致死量LD₅₀( 50% lethal dose)：用動物或雞胚來檢測
半數(shù)雞胚感染量EID₅₀(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測
半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量TCID₅₀（50% tissue culture infective dose)：用細胞來檢測
蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU）：用細胞來檢測
三、材料 
1、長滿單層的細胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生長液
3、96孔細胞培養(yǎng)板
4、加樣器、槍頭
5、病毒液（PRV）
四、TCID₅₀的操作步驟
1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10^-1-10^-10。
2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100µl。
3、在每孔加入細胞懸液100µl，使細胞量達到2~3×10⁵個/ml。
4、設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。（100µl生長液+100µl細胞懸液）#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
5、逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。
6、結(jié)果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法
五、TCID₅₀的計算方法
1、Reed-Muench兩氏法

病毒液稀釋度	出現(xiàn)CPE孔數(shù)	無CPE孔數(shù)	累    計		出現(xiàn)CPE孔所占的%
			CPE孔數(shù)	無CPE孔數(shù)
10-1	8	0	27	0	100（27/27）
10-2	8	0	19	0	100（19/19）
10-3	7	1	11	1	91.6 （11/12）
10-4	3	5	4	6	40（4/10）
10-5	1	7	1	13	0.7（1/14）
10-6	0	8	0	21	0（0/21）

CPE：Cytopathic effect
距離比例＝（高于50%病變率的百分數(shù)-50%）/（高于50%病變率的百分數(shù)-低于50%病變率的百分數(shù)）
        ＝（91.6-50）/（91.6-40）
       ＝ 0.8
lgTCID₅₀=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)
       =0.8×(-1)+(-3)
       =-3.8
TCID₅₀=10^-3.8/0.1ml
含義：將該病毒稀釋10^3.8接種100µl可使50%的細胞發(fā)生病變。
2、Karber法

病毒液稀釋度	出現(xiàn)CPE的孔數(shù)	出現(xiàn)CPE孔的比率
10-1	8	8/8=1
10-2	8	8/8=1
10-3	7	7/8=0.875
10-4	3	3/8=0.375
10-5	1	1/8=0.125
10-6	0	0/8=0

 
lgTCID₅₀=L-d(s-0.5)
L：**高稀釋度的對數(shù)
D：稀釋度對數(shù)之間的差
S：陽性孔比率總和
lgTCID₅₀=-1-1×(3.375-0.5)
       =-3.875
TCID₅₀=10^-3.875/0.1ml
含義：將該病毒稀釋10^3.875接種100µl可使50%的細胞發(fā)生病變。
 
  
Marc 145細胞培養(yǎng)和維持綜述 
發(fā)布: 2010-02-10 來自: 易生物實驗 閱讀數(shù)：5241次 
一、 細胞及培養(yǎng)
1、Marc145細胞
上皮樣細胞，來源于猴腎細胞，從母細胞（MA 104細胞）克隆而得到，可連續(xù)培養(yǎng)。
2、生長培養(yǎng)基
DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉）＋5－10％新生牛血清+ 1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的培養(yǎng)液。
3、凍存液
生長培養(yǎng)基＋10% DMSO
4、細胞健康生長的幾項注意事項
（1）細胞沒有支原體等外源因子的感染。
（2）培養(yǎng)液的pH值可在7.0－7.3，以7.2為佳。#p#分頁標題#e#
（3）一般按1：3傳代，細胞接種密度為1－1.5×105cells/ml，48hr后長成單層。#p#分頁標題#e#
（4）培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量可靠、穩(wěn)定；建議采用特級小牛血清。
（5）細胞及時傳代，不可以在老化后傳代，一般在剛長成細胞單層時進行傳代、擴增。
（6）細胞傳代時消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化過程應盡量縮短在1～2分鐘內(nèi)完成。
二、 病毒感染、維持和收獲
轉(zhuǎn)瓶中細胞長成單層后，棄瓶內(nèi)細胞生長液，接種PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入維持液，置37℃恒溫室轉(zhuǎn)瓶機上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3－5天。
維持液：DMEM+4～5％新生牛血清。
pH應為7.4～7.8；后期維持pH會慢慢降下來。
細胞病變時間出現(xiàn)在接毒后48小時，72～96小時細胞病變達80％左右，當細胞出現(xiàn)80%以上病變（CPE）時，即可開始收毒；反復傳過幾代后病變時間可縮短。
第3、4天注意觀察，細胞病變（CPE）達到80％時收獲病毒，－20℃凍融3次，混勻病毒懸液，96孔板測定TCID50。
收液時需要將含毒細胞反復凍融2～3次以破碎細胞，將病毒釋放到培養(yǎng)液中。
三、 細胞病變（CPE）
細胞在接種病毒后，24－48hr開始出現(xiàn)病變，72－96hr約達到80％病變。病變現(xiàn)象：細胞空泡化、圓縮、先灶狀脫落，再大片脫落，**后整個細胞裂解、破碎。圖1是指PRRSV感染后，出現(xiàn)細胞病變的Marc 145細胞。
四、 PRRS病毒在細胞中增殖規(guī)律（ Virology Journal, 2006, 3: 90）
PRRS病毒感染Marc 145細胞過程可大致分為兩個感染階段，**階段：病毒感染細胞后的20－22hr左右，僅部分細胞被隨機感染，而且Marc 145細胞對PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）與MOI量無關(guān)，因為MOI劑量比常規(guī)量提高100倍，感染22hr后，仍僅5.5%的細胞呈PRRSV陽性（PRRSV-positive）。第二階段：感染后的2－3天（也稱為病毒的對數(shù)感染期），病毒感染蔓延是通過相鄰細胞和細胞之間的接觸感染，細胞對自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出現(xiàn)了感染細胞群。 感染過程如圖5所示。
對我們的一點啟示：可以采用適當?shù)土康腗OI進行病毒感染，比如0.05virus/cell；同時，大部分細胞在維持期的**天尚需繼續(xù)生長，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，較長的病毒維持期均需要供給豐富的營養(yǎng)物資，可以相信：維持液的營養(yǎng)成分對病毒增殖效率有非常重要的影響
細胞的復蘇
一、細胞復蘇的原則
在實際操作中，凍存細胞要進行復蘇，再培養(yǎng)傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。
二、細胞復蘇的主要操作步驟
(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其完全融化，然后在無菌下取出細胞。
(3)在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代。或無需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12～24小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
三、注意事項
在細胞復蘇操作時，應注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過**易受損的溫度段(-5～0℃)。這樣復蘇的凍存細胞存活率高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死亡)的細胞輕輕倒掉，再補以適量的新培養(yǎng)液，也會獲得較為滿意的結(jié)果。